ОБЗОР

Проведен анализ литературы, посвященной методам определения общего белка в сыворотке крови. Представленные в обзоре данные указывают на то, что использование биуретового реактива, приближающегося по составу к референтному, а также стандартных растворов белка на основе бычьего сывороточного альбумина позволяет стандартизировать методы определения и получать сопоставимые результаты в различных лабораториях.

Белки сыворотки крови представляют собой гетерогенную группу белков, включающую транспортные белки, ферменты, иммуноглобулины, гормоны, белки-ингибиторы и многие другие. Несмотря на различия в структуре, белкам сыворотки присущ ряд общих характеристик:
1) содержат атомы углерода, водорода, кислорода, азота;
2) аминокислоты в цепи соединены пептидными связями;
3) обладают поглощением в ультрафиолетовой области спектра;
4) сходно ведут себя в ряде химических реакций.
Исходя из этих свойств, были разработаны методы определения белка в биологических жидкостях [1].

Ввиду того, что белки являются соединениями, в состав которых обязательно входит азот, для количественного определения белка в биологическом материале использовали определение содержания азота. В методе Кьельдаля, в настоящее время представляющем в целом исторический интерес, азот, содержащийся в составе белков, окисляют до NH₄⁺ , и его количество определяют титрованием точным раствором соляной кислоты. Кроме того, NH₄⁺ может быть определен реактивом Несслера, манометрическим методом после превращения NH₄⁺ в N₂ под действием гипобромита или с помощью оптического теста Варбурга при участии фермента глутаматдегидрогеназы:

Глутаматдегидрогеназа
NH₄⁺+ α-кетолутарат + НАДФН₂ ------> L-глутамат + НАДФ + Н₂О Исходя из того, что белки из биологических объектов содержат в среднем 16 % азота, полученное в результате анализа количество азота умножают на коэффициент 6,25. Исторически используют фактор 6,25, хотя его величина зависит от белкового состава исследуемого образца. Для отдельных фракций белка в сыворотке или плазме величина фактора колеблется в диапазоне от 5,69 до 6,52 [2].

Метод Кьельдаля до сих пор используют в качестве метода сравнения из-за его достаточной точности и воспроизводимости. Его недостатком является длительность и сложность процедуры, даже при том, что аммиак, образующийся в реакции, можно определять ферментативным методом. Автоматизация позволяет использовать этот метод в качестве метода сравнения.

Прямые методы определения белка включают поглощение в ультрафиолетовой области спектра, рефрактометрию и светорассеивание.

Растворы белка обладают поглощением при 270–290 и 200–225 нм (рис 1).

Поглощение при 270–290 нм определяется присутствием в молекуле белка ароматических аминокислот — тирозина, триптофана и фенилаланина. Поглощение при 200–225 нм практически в 20 раз выше, чем при 280 нм, и обусловлено главным образом пептидными связями.

Точность и специфичность методов определения белка, основанных на поглощении при 270 –290 нм, невелика, поскольку содержание тирозина и триптофана может колебаться в различных белках сыворотки крови. Кроме того, присутствие в сыворотке свободных аминокислот — тирозина и триптофана, мочевой кислоты и билирубина, поглощающих при 280 нм, вносит определенную погрешность. Данный метод не используют для прямого определения содержания общего белка в сыворотке.

Напротив, поглощение в ультрафиолетовой области — 200 – 225 нм обусловлено в основном пептидными связями, в связи с чем величина поглощения различных белков сыворотки различается незначительно. В этом спектральном диапазоне закон Бера соблюдается до концентрации белка в сыворотке 120 г/л [3].

Определение общего белка сыворотки крови с помощью прямой фотометрии при 210 нм обеспечивает получение результатов, сравнимых с биуретовым методом и методом Кьельдаля. В то же время данный метод практически не применяется из-за необходимости использования кювет, не поглощающих при 210 нм, и монохроматора, что удорожает метод.

Рефрактометрический метод основан на способности растворов белка к преломлению светового потока. При температуре 17,5 °С показатель преломления воды равен 1,3332, при той же температуре показатель преломления сыворотки колеблется в пределах 1,3480–1,3505. В связи с тем, что концентрация электролитов и небелковых органических соединений, влияющих на ее преломляющую способность, невелика и достаточно постоянна в сыворотке здорового человека, величина показателя преломления сыворотки крови зависит в первую очередь от содержания в ней белков. Калибровку прибора проводят сывороткой с известной концентрацией белка. Простота делает рефрактометрию удобным методом для определения содержания белка в сыворотке крови, хотя при ряде заболеваний, в частности, при сахарном диабете, хронической почечной недостаточности его использование может приводить к существенной ошибке.

«Преципитационные» методы
Они основаны на снижении растворимости белков и образования суспензии взвешенных частиц под воздействием различных агентов. О содержании белка в исследуемой пробе судят либо по интенсивности светорассеяния (нефелометрический метод анализа), определяемого числом светорассеивающих частиц, либо по ослаблению светового потока образовавшейся суспензией (турбидиметрический метод анализа).

Результаты данной группы методов зависят от множества факторов: скорости смешивания реактивов, температуры реакционной смеси, значения рН среды, присутствия посторонних соединений, способов фотометрии. Тщательное соблюдение условий реакции способствует образованию стабильной суспензии с постоянным размером взвешенных частиц и получению воспроизводимых результатов. «Преципитационные» методы для определения белка в сыворотке крови не получили признания и нашли применение при определении белка в моче, спинномозговой жидкости и многих специфических белков с использованием специфичных антител [4].

Непрямые методы определения общего белка основываются на образовании комплексов, интенсивность окраски которых оценивают с помощью фотометрии. Один из таких методов — биуретовая реакция. В данной реакции после добавления к щелочному раствору белка ионов меди образуются комплексные соединения меди фиолетового или красно-фиолетового цвета. Название реакция получила от биурета (carbamylurea, NH₂CONHCONH₂) — соединения, образующегося при нагревании мочевины до 180 °C.

Максимум поглощения биуретового комплекса отдельных белков может сдвигаться, но в целом поглощение, измеренное против биуретового реактива при длине волны 540 нм, пропорционально числу пептидных связей. Если поглощение определяют против воды, максимум регистрируют при 580 нм (рис 2).

Эти различия в максимуме поглощения белков обусловлены главным образом липидным или углеводным компонентом молекулы белка, а не пептидной связью.

Для количественного определения низких концентраций белка широко используют метод Лоури. В данном методе сочетаются две реакции. Первая — биуретовая реакция. Во второй реакции (собственно реакция Фолина) задействован реактив Фолина—Чокальтеу. В ней образуются окрашенные в синий цвет комплексы фосфорно-вольфрамовой и фосфорно-молибденовой кислоты под действием тирозина и триптофана, входящих в состав белков [5].

Аминокислоты — цистин, цистеин, гистидин — способны реагировать с реактивом Фолина, что может вносить определенную ошибку в конечный результат. Метод Лоури в силу его большей чувствительности по сравнению с биуретовым методом обычно используют для определения низких концентраций белка (в пределах 10–60 мг/л). Его применяют в научных исследованиях и практически не используют в клинических лабораториях. В определенной мере это связано с его невысокой специфичностью, поскольку содержание тирозина в белках сыворотки может колебаться, и поглощение различных белков будет различное. Например, величина поглощения γ-глобулинов на 23 % выше, чем у альбумина [6]. Поскольку тирозин вносит основной вклад в реакцию Фолина, результаты определения белка в сыворотке крови пациентов с различными заболеваниями могут не коррелировать с результатами более специфичного биуретового метода. Другой недостаток метода Лори заключается в том, что в нем используют два реактива, и оба имеют небольшой срок годности.

Способность белков связывать некоторые красители (Amido Black 10B и Coomassie Brilliant Blue) используют в спектрофотометрических методах определения белка. Эти красители связываются с протонированными аминогруппами остатков аминокислот в полипептидной цепи и сдвигают максимум поглощения комплекса краситель — белок. Данную группу методов в основном используют для определения белка в спинномозговой жидкости, моче и других биологических жидкостях и для окраски электрофореграмм после электрофореза [7, 8].

Референтный метод
В 1981 г. B. Doumas и соавторы предложили использовать в качестве референтного метод определения общего белка в сыворотке крови, основанный на биуретовой реакции [9]. Данный выбор базируется на относительной специфичности биуретовой реакции для белков, воспроизводимости условий реакции, близкие значения величины поглощения основных белков сыворотки и относительно небольшого числа соединений, способных вмешиваться в реакцию. Метод был адаптирован ко многим анализаторам. Биуретовая реакция была приспособлена для определения белка в технологии «сухой» химии.

Скорость развития окраски в биуретовой реакции зависит от времени и температуры реакции. Проблема относительно невысокой скорости реакции может быть преодолена в анализаторах с высокой производительностью, используя кинетический подход к регистрации поглощения за более короткий период реакции. Окраска цветного комплекса устойчива в течение нескольких часов.

Линейность биуретовой реакции зависит от концентрации ионов меди в реакционной среде. При снижении концентрации ионов меди отклонение от линейности наблюдают при более низкой концентрации белка. При более высокой концентрации меди содержание гидроокиси натрия должно быть увеличено для стабилизации ионов меди в растворе. Если реактив является слишком щелочным, то может развиваться помутнение среды при длительности инкубации более 30 мин.

Из наиболее широко используемых прописей биуретового реактива в настоящее время можно выделить две основные.

В первой группе концентрация гидрокисида натрия составляет 0,1–0,2 моль/л и концентрация сульфата меди 10–30 ммоль/л. В другой группе концентрация гидрокисида натрия от 0,5 до 0,8 моль/л и сульфата меди — 4–6 ммоль/л. В реактиве, предложенном Doumas, имеется более высокая концентрация сульфата меди (12 ммоль/л) и, соответственно, более высокая концентрация гидрокисида натрия (0,6 моль/л).

Для стабилизации раствора используют комплексон — винную кислоту (Tartaric acid), что предотвращает осаждение Cu2+ в щелочных условиях, йодид калия предотвращает окисление щелочного медного тартрата и образования окиси меди.

Состав реактива должен, насколько возможно, приближаться по составу к рекомендованному Doumas и гарантировать поведение калибраторов и исследуемых образцов. Время реакции и температура должны обеспечить стабильность спектральных характеристик при использовании калибраторов, приготовленных на основе плазмы человека или животных. Температура должна быть стабильна как в методах с фиксированным временем инкубации (end point), так и в методах с непрерывной регистрацией. Температуру 37 °C рекомендуют для минимизации времени реакции. Все методы должны также включать коррекцию неспецифичного фона сыворотки [10, 11].

Был предпринят ряд шагов по стандартизации методов определения общего белка сыворотки крови. Национальный комитет клинических лабораторных стандартов (NCCLS) предложил использование бычьего альбумина сыворотки в качестве референтного материала для определения общего белка спектрофотометрическим, биуретовым и методом Лоури.

Национальное бюро стандартов (NBS) выпустило готовый препарат бычьего сывороточного альбумина, удовлетворяющего требованиям NCCLS. Он доступен в лиофилизированной форме и в виде раствора 70 г/л (1,06 ммоль/л) (SRM N 927). Средняя величина поглощения последнего раствора была определена как 0,2983 лxг^-1x см^-1 (1,976 лxг^-1x см) при использовании реактива Doumas [12,13].

Эти образцы альбумина рекомендуют в качестве стандарта для биуретового метода. Были предложены методы изготовления вторичных стандартов и образцов альбумина, поскольку для стандарта необходим материал, состоящий только из аминокислот, содержание азота, постоянная доля его молекулярной массы и число пептидных связей в молекуле строго определено. Биуретовый реактив образует комплексы с бычьим альбумином сыворотки, человеческим альбумином сыворотки и различными фракциями белков сыворотки крови при условии, что реакции позволяют достигнуть завершения [14].

В то же время человеческий альбумин сыворотки обладает более низкой начальной скоростью реакции с биуретовым реактивом по сравнению с бычьим альбумином сыворотки. В связи с этим методы, основанные на измерении начальной скорости реакции, должны быть стандартизированы с использованием человеческого альбумина .

В системе внешней оценки качества определения общего белка в сыворотке крови в Великобритании используются образцы сыворотки человека [15].

Исследуемые образцы
Для анализа могут использоваться как сыворотка, так и плазма. При этом обычно получают сравнимые результаты, хотя, из-за присутствия фибриногена, уровень общего белка в плазме на 2–4 г/л выше, чем в сыворотке. На преаналитическом этапе голодание не требуется, но в целом — желательно для уменьшения степени липемии. Содержание общего белка устойчиво в сыворотке и плазме в течение 1 недели при комнатной температуре и, по крайней мере, 2 месяца при -20 °C [16]. Прогревание образцов сыворотки при температуре 56 °C в течение 30 минут не приводит к клинически значимым изменениям концентрации общего белка [17]. Образцы сыворотки с выраженной липемией следует отметить перед исследованием [18]. Определение содержания белка в сыворотке, полученной в вакуумных системах с разделяющим гелем и без него, даёт сопоставимые результаты. Не было получено существенных различий в содержании белка в образцах крови, собранных в стеклянных или пластмассовых вакуумных системах [19].

Вмешательства
Список соединений, вмешивающихся в биуретовую реакцию и влияющих на результаты метода, относительно невелик. Среди них низкомолекулярные декстраны, способные вмешиваться в биуретовую реакцию [20].

Декстраны, используемые в качестве плазмозамещающих растворов, образуют комплекс с медью и тартратом в реакционной смеси и приводят к образованию рыхлого синего осадка. Степень вмешательства зависит от концентрации декстрана и состава биуретового реактива [21]. При вводимых обычно количествах декстрана величина ошибки может составлять от 3 до 50 %. Полагают, что добавление глицерина в реактив или использование низкой концентрации NaOH способны предотвратить вмешательства декстрана в ход реакции. Каждая лаборатория должна оценить эффект декстрана на результаты используемого ими метода.

Присутствие в образце ионов аммония может способствовать образованию комплексов аммония с ионами меди, приводить к снижению концентрации ионов меди в реакционной среде, и, соответственно, к снижению скорости реакции и ложноотрицательным результатам [22]. Существенного вмешательства других лекарственных препаратов в терапевтических концентрациях в результаты определения общего белка биуретовым методом не было выявлено.

Выраженный гемолиз, липемия или желтушные образцы могут увеличить величину поглощения при 540 нм и привести к ложноположительным результатам. Присутствие гемоглобина приводит к завышению результатов на 3 % на каждый 1 г/л свободного гемоглобина в сыворотке [23]. Для того чтобы избежать получения ложно завышенных результатов, используют следующие приемы:

— разведение образца;
— использование отдельного контроля;
— измерение при двух длинах волн;
— измерение в кинетическом режиме.

Референтные интервалы
При использовании метода Doumas диапазон референтных значений в сыворотке для мужчин (n = 134) и женщин (n = 97) составляет от 66,6 до 81,4 г/л [24]. У мужчин результаты приблизительно на 1 г/л выше, чем у женщин; это различие, скорее всего, не имеет клинического значения. В исследуемые группы были включены здоровые взрослые, голодавшие в течение 10–12 часов и находившиеся в вертикальном положении за 2 часа до забора крови. Не было выявлено влияния приема пищи на уровень общего белка в сыворотке крови. Этот диапазон близок к установленному Reed и соавторами [25] — от 66 до 83 г/л у 1419 обследованных. Указывают на индивидуальные колебания ± 4 г/л уровня общего белка в крови у здоровых молодых взрослых. Не было выявлено сезонных и дневных колебаний [26].

У взрослых наблюдают небольшое и, вероятно, клинически незначимое уменьшение концентрации общего белка в сыворотке с возрастом . У новорожденных средняя концентрация белка сыворотки находится в пределах 57 г/л. К 6 месяцам жизни она увеличивается до 60 г/л (±4 г/л) и достигает уровня взрослых приблизительно к 3 летнему возрасту. Уровень белка в сыворотке у недоношенных может быть намного ниже, чем у доношенных, в пределах от 36–60 г/л. После 60 лет уровень белка в сыворотке крови приблизительно на 2 г/л ниже.

Нарушение соотношения между объемом внутри— и внеклеточной жидкости может вызвать существенные изменения концентрации белка в сыворотке крови. Например, общий белок сыворотки ниже на 4–8 г/л у людей, находящихся в горизонтальном по сравнению с вертикальным положением. Кроме того, в течение нескольких часов после тяжелой физической нагрузки может быть отмечено увеличение концентрации белка сыворотки крови на 4–8 г/л. При беременности концентрация белка в сыворотке может уменьшаться до 61–69 г/л. Лечение эстрогенами приводит к уменьшению содержания общего белка сыворотки, тогда как данные о влиянии стероидных контрацептивов противоречивы [30].

Интерпретация результатов

Две основные причины изменений общего белка в сыворотке — изменение объема плазменной воды и концентраций одного или большего количества отдельных белков в плазме. Уменьшение объема плазменной воды (гемоконцентрация) приводит к относительной гиперпротеинеми и увеличению концентрации всех белков. Это отмечают при обезвоживании в результате недостаточного поступления воды или из-за чрезмерной ее потери при неукротимой рвоте, диарее, болезни Аддисона или диабетическом кетоацидозе. С другой стороны, увеличение объема плазменной воды (гемодилюция) сопровождается относительной гипопротеинемией и уменьшением концентрации всех белков при длительных внутривенных инфузиях.

Заболевания, затрагивающие концентрацию альбумина и/или иммуноглобулинов, приводят к изменению уровня общего белка в сыворотке крови. Другие белки в сыворотке не содержатся в концентрации, достаточной для оказания существенного эффекта. Недостаток белка в пище, нарушения процессов переваривания или всасывания могут привести к уменьшению уровня белка в сыворотке крови, прежде всего альбумина, в сыворотке. Тяжелые заболевания печени также приводят к снижению уровня белка в сыворотке. Заболевания почек, в частности гломерулонефрит, нефротический синдром и поражение проксимальных канальцев в конечном итоге могут привести к уменьшению уровня общего белка в сыворотке. Снижение концентрации белка сыворотки ниже 40 г/л обычно сопровождается отеками.

Увеличение концентрации общего белка сыворотки может быть вызвано увеличением концентрации отдельных белков, обычно присутствующих в относительно невысоких концентрациях, например, острофазовых белков и иммуноглобулинов при инфекционных процессах. Гиперпротеинемия может быть обусловлена высоким уровнем моноклональных иммуноглобулинов при множественной миеломе и других парапротеинемиях.

Список литературы

1. Archibald R.M. Nitrogen by the Kjeldahl method // Stand. Methods Clin. Chem. 1958. Vol. 2. P. 91–99.
2. Silverman L.S., Christenson R.H. Methods for determination of proteins in serum and plasma. In: Tietz Textbook of Clinical Chemistry. Burtis C.A., Ashwood E.R. Eds. Philadelphia. 1994. P. 695–704.
3. Ressler N., Gahkoff M., Fischinger A. Improved method for determining serum protein concentration in the far ultraviolet // Clin. Chem. 1976. Vol. 22. P. 1355–1369.
4. Renoe B.W., Combs G.L., Coffee E.E., DeGrella R.F. Critical evaluation of the TDx Turbo nephelometry system // Clin. Chem. 1988. Vol. 34. P. 2524–2527.
5. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin reagent // J. Biol. Chem. 1951. Vol. 193. P. 265–275.
6. Peterson GL. Review of the Folin phenol protein quantitation method of Lowry, Rosebrough, Fair and Randall // Anal. Biochem. 1979. Vol. 100. P. 201–220.
7. Lott, J.A., Stephan, V.A., Pritchard, K.A. Evaluation of the Coomassie Brilliant Blue G-250 method for urinary protein //Clin. Chem. 1983. Vol. 29. P. 1946–1950.
8. Johnson A., Lott J.A. Standardization of the Coomassie Brilliant Blue method for cerebrospinal fluid proteins // Clin. Chem. 1978. Vol. 24. P. 1931–1933.
9. Doumas B.T., Bayse D.D., Carter, R.J. et al. A candidate reference method for determination of total protein in serum. I. Development and validation. Clin. Chem. 1981. Vol. 27. P. 1642–1650.
10. Doumas B.T. Standard for total serum protein assays - a collaborative study // Clin. Chem. 1975. Vol. 24. P. 1159–2266.
11. Dawnay A.B. St. J., Hirst A.D., Perry D.E., Chambers R.E.A critical assessment of current analytical methods for the routine assay of serum total protein and recommendations for their improvement // Ann. Clin. Biochem. 1991. Vol. 28. P. 556–567.
12. Reeder D.J., Schaffer R. Standard reference material (SRM) for total protein determination - bovine serum albumin // Clin. Chem. 1977. Vol. 23. P. 1136.
13. Doumas B.T., Bayse D.D, Borner K. et al.A candidate reference method for determination of total protein in serum II. Test for transferability // Clin. Chem. 1981. Vol. 27. P. 1651–1654.
14. Doumas B.T., Bayse D.D., Carter, R.J. et al. A candidate reference method for determination of total protein in serum. I. Development and validation // Clin. Chem. 1981. Vol. 27. P. 1642–1650.
15. Dawnay A.B., Hirst A.D., Perry, D.E., Chambers R.E. A critical assessment of current analytical methods for the routine assay of serum total protein and recommendations for their improvement // Ann. Clin. Biochem. 1991. Vol. 28. P. 556–567.
16. Peters T. Jr., Biamonte G.T., Doumas, B.T. Protein (total protein) in serum, urine and cerebrospinal fluid; albumin in serum. In: Faulkner W.R., Meites S., Eds. Selected methods of clinical chemistry. Washington. 1982. AACC. Vol. 9. P. 317–325.
17. Houssein I., Wilcox H., Barren J. Effect of heat treatment on results for biochemical analysis of plasma and serum // Clin. Chem. 1985. Vol. 31. P. 2028–2030.
18. Peters T. Jr., Biamonte G.T., Doumas B.T. Protein (total protein) in serum, urine, and cerebrospinal fluid; albumin in serum. In: Faulkner W.R., Meites S., Eds. Selected methods of clinical chemistry. Washington DC. 1982, AACC, Vol. 9. P. 317–325.
19. Hill B.N., Laessig R.H., Koch D.D. et al. Comparison of plastic versus glass evacuated serum-separator (SST) blood-drawing tubes for common clinical chemistry determinations // Clin. Chem. 1992. Vol. 38. P. 1474–1478.
20. Doumas B.T., Bayse D.D., Carter R.J. et al. A candidate reference method for determination of total protein in serum. I. Development and validation // Clin. Chem. 1981. Vol. 27. P. 1642–1650.
21. Barnes D.B., Pierce G.F., Lichti D. et al. Effects of dextrans on five biuret-based procedures for total protein in serum // Clin. Chem. 1985. Vol. 31. P. 2018–2019.
22. Cannon D.C., Olitzky I., Inkpen J.A. Proteins. In: Henry, R.J., Cannon D.C., Winkelman J.W., Eds. Clinical chemistry: Principles and techniques. London. 1974. P. 405–502.
23. Reed A.H., Cannon D.C., Winkelman J.W. et al. Estimation of normal ranges from a controlled sample survey. I. Sex and age-related influence on the SMA 12/60 screening group of tests // Clin. Chem. 1972. Vol. 18. P. 57–66.
24. Young D.S., Harris E.T., Cotlove E. Biological and analytic components of variation in long-term studies of serum constituents in normal subjects // Clin. Chem. 1971. Vol. 17. P. 403–410.
25. ZIotkin S.H., Casselman C.W. Percentile estimated of reference values for total protein and albumin in sera of premature infants (less than 37 weeks of gestation) // Clin. Chem. 1987. Vol. 33. P. 411–413.
26. Elliot, J.R. and O’Kell R.T. Normal clinical chemistry values for pregnant women at term // Clin. Chem. 1971. Vol. 17. P. 156–157.
27. Musa B.U., DoeR.P. Seal U.S. Serum protein alterations produced in women by synthetic estrogens // J. Clin. Endocrinol. 1967. Vol. 27. P. 1463–1469.

к главной странице | к содержанию | к предыдущей странице | к следующей странице |