ГЕМАТОЛОГИЯ

Представлена FAB-классификация острых лейкозов, основные цитохимические методы их дифференциальной диагностики (исследования на миелопероксидазу, липиды, гликоген, неспецифическую эстеразу). Дан алгоритм цитохимической диагностики острых лейкозов на основании последовательного применения основных цитохимических реакций. На практике рекомендовано использование цитохимических наборов серии «Диахим-ЦитоСтейн» производства НПФ «Абрис+».

Во всем мире наметилась тенденция к увеличению заболеваемости острыми лейкозами. По данным Министерства здравоохранения РФ, в России ежегодно регистрируется до 3000 случаев вновь выявленных лейкозов только у детей младше 14 лет и около 5000 случаев – у подростков в возрасте до 18 лет.

Разработка и внедрение в клиническую практику современных программ терапии острых лейкозов, основной из которых является трансплантация костного мозга, привело к существенному улучшению результатов лечения, увеличению продолжительности жизни больных, а во многих случаях и к полному их излечению. В этой связи вопросы дифференциальной диагностики острых лейкозов выходят на первый план, поскольку во многом позволяют определить своеобразие клинического течения заболевания и, как следствие, тактику лечения, а также дают возможность составить ближайший прогноз.

Несмотря на появление в последние десятилетия методов иммунофенотипирования лейкемических клеток, цитогенетического и молекулярногенетического анализа цитоморфологические и цитохимические методы исследования не утратили своего значения для диагностики различных форм гемобластозов. Именно эти методы положены в основу современной классификации острых лейкозов FAB (Франко-Американо-Британской, 1976 г.), основанной на клоновой теории их патогенеза и на представлении о том, что каждая опухолевая клетка имеет своего «нормального» предшественника. Особенно велика роль этих методов в верификации острых миелоидных лейкозов, где результатов морфологического и цитохимического исследований в большинстве случаев бывает достаточно для постановки окончательного диагноза. Согласно FAB-классификации, все лейкозы подразделяются на две большие группы: острые миелоидные (нелимфобластные – ОНЛЛ) и острые лимфобластные (ОЛЛ).

FAB-классификация острых лейкозов

Острые миелобластные лейкозы
•  М0 – о. миелобластный лейкоз с минимальной миелоидной дифференцировкой бластов
•  М1 – о. миелобластный лейкоз без созревания
•  М2 – о. миелобластный лейкоз с созреванием
•  М3 – о. промиелоцитарный лейкоз
•  М4 – о. миеломонобластный лейкоз
•  М4эоз.- о. миеломонобластный лейкоз с эозинофилией
•  М5а – о. монобластный лейкоз без созревания
•  М5б – о. монобластный лейкоз с созреванием
•  М6 – о. эритромиелоз
•  М7 – о. мегакариобластный лейкоз

Острые лимфобластные лейкозы
•  L1 – о. лимфобластный лейкоз с микроформой бластов
•  L2 – о. лимфобластный лейкоз с гетерогенными формами бластов
•  L3 – о. лимфобластный лейкоз с беркиттоподобными бластами
Объектами цитохимического исследования могут служить мазки периферической крови, пунктаты костного мозга, лейкоконцентрат венозной крови, спинномозговой жидкости, аспираты лимфатических узлов, селезенки, лейкозных инфильтратов различной локализации.

Цитохимические методы представляют собой достаточно простые, хорошо воспроизводимые, не требующие сложной аппаратуры методики, которые могут быть освоены в любой лаборатории. Кроме того, в настоящее время выпускаются готовые коммерческие наборы (фирма «Абрис+»), рассчитанные на проведение небольшого количества исследований единовременно, что значительно упрощает выполнение методик и позволяет получать хорошие результаты.

Среди множества клеточных компонентов, таких как неорганические элементы, белки, аминокислоты, углеводы, различные ферменты, которые могут быть определены с помощью цитохимических реакций, Международный совет по стандартизации в гематологии, в соответствии с FAB-классификацией острых лейкозов, рекомендовал использовать в качестве основных для их дифференциальной цитохимической диагностики следующие: на миелопероксидазу, липиды, гликоген, неспецифическую эстеразу.

Миелопероксидаза (МПО)

Пероксидаза является лизосомальным ферментом, катализирующим в присутствии перекиси водорода (Н2О2) окисление различных субстратов. Миелопероксидаза (МПО) локализуется преимущественно в специфических азурофильных гранулах в цитоплазме гранулоцитов и является маркером клеток миелоидного ряда. В клетках МПО участвует в реакции разрушения токсичной перекиси водорода. В цитохимических реакциях активность фермента определяется по окислению хромогенов (бензидина, о-дианизидина и др.) по методу Грехема – Кнолля.

МПО выявляется в клетках гранулоцитарного ряда начиная с миелобласта. Активность фермента нарастает по мере созревания клеток. В сегментоядерных нейтрофилах здоровых людей выявляется высокая активность МПО в виде гранул, заполняющих цитоплазму.

Самая высокая активность фермента наблюдается в зрелых эозинофилах. В базофильных промиелоцитах и миелоцитах активность МПО, как правило, высокая, однако по мере дифференцировки их в зрелые клетки активность фермента снижается. Зрелые базофилы могут быть почти отрицательными по данному признаку. Слабоположительная реакция на МПО наблюдается в различном проценте моноцитов в виде немногочисленных рассеянных гранул. В эритрокариоцитах, лимфоцитах, и мегакариоцитах МПО не определяется.

Нормальные величины
В крови здоровых людей 3 - 16% нейтрофилов имеют резко положительную, 60–90% – умеренно положительную, остальные – слабо положительную реакцию на МПО. СЦК нейтрофилов здоровых людей равен 2,56±0,33.

Клиническое значение определения МПО
Реакция используется главным образом с целью диагностики острых лейкозов. При острых миелобластных лейкозах активность фермента в опухолевых клетках варьируется от слабой до выраженной, в зависимости от степени дифференцировки бластов. Так, при острых миелобластных лейкозах с низкой степенью дифференцировки (М1 по FAB-классификации) количество МПО-положительных бластов невелико (не превышает 10%), степень активности фермента в них невысокая. При остром промиелоцитарном лейкозе (М3 по FAB-классификации) МПО выявляется практически в 100% бластных клеток, причем активность ее равноценна таковой у зрелых нейтрофилов. Однако отсутствие точных количественных способов оценки цитохимических реакций не позволяет использовать их для верификации степени дифференцировки бластных клеток, следовательно, и более тонкой дифференциальной диагностики ОЛ. Таким образом, с помощью цитохимических реакций определяют линейную направленность, а не степень дифференцировки бластов.

При острых монобластных лейкозах реакция на МПО в опухолевых клетках слабая, при острых лимфобластных – отрицательная.

Липиды

Липиды обнаруживаются практически во всех лейкоцитах, за исключением лимфоцитов. Однако основная масса липидов связана с клетками гранулоцитарного ряда. Они входят в состав специфической зернистости нейтрофильных гранулоцитов, эозинофилов и накапливаются по мере созревания клеток. В миелобластах обычно имеется небольшое количество гранул, локализующихся в перинуклеарной зоне, в промиелоцитах их становится несколько больше, в миелоцитах и метамиелоцитах содержание суданофильных гранул высокое. В зрелых нейтрофилах липиды заполняют всю цитоплазму. В моноцитах и их предшественниках часто содержится различное число мелких или умеренно крупных гранул, распределенных по всей клетке, с некоторой тенденцией к концентрированию в перинуклеарной зоне или ободке цитоплазмы. Эритрокариоциты, ретикулоциты и зрелые эритроциты не содержат суданофильных гранул. В клетках лимфоидного ряда липиды не выявляются.

Стабильные и хорошо воспроизводимые результаты для исследования гемопоэтических клеток получаются при применении метода с суданом черным В по методу Sheehan и Storey.

Нормальные величины
Большинство нейтрофилов (69-80%) у здоровых людей имеет резко выраженную, 18-36% – умеренно выраженную и 10% – слабо выраженную реакцию на липиды.

Клиническое значение определения липидов
Особую информативность реакция с суданом черным В имеет при дифференциальной диагностике острых лейкозов. Обычно липиды выявляются параллельно с миелопероксидазой, но могут обнаруживаться и в менее зрелых миелобластах при отсутствии МПО, т.е. являются более чувствительным маркером миелоидной дифференцировки.

Однако описаны крайне редкие случаи выявления липидов в лимфобластах. В соответствии с FAB-классификацией, при диагностике острых лейкозов для подтверждения миелоидной природы бластов необходимо наличие не менее 3% бластных клеток, положительных по МПО и/или липидам.

Уменьшение суданофилии с появлением отдельных сегментоядерных нейтрофилов, не содержащих липидов, отмечается при ХМЛ.

PAS-реакция

Механизм РАS-реакции основан на окислении йодной кислотой гликолевых групп или их амино- или алкиламино- производных до альдегидов. Альдегидные группировки при взаимодействии с реактивом Шиффа образуют продукт красного цвета (метод Mc Manus).

Мукополисахариды (новое название – гликозамингликаны) определяются во всех морфологически идентифицируемых клетках гранулоцитарного ряда. Концентрация PAS-положительного материала в клетках гранулоцитопоэза нарастает по мере созревания клеток. Диффузное окрашивание цитоплазмы обычно свойственно наиболее молодым клеткам гранулоцитарного ряда (миелобласты, промиелоциты, миелоциты). В зрелых нейтрофилах содержится много PAS-положительного вещества в виде мелких гранул, упакованных так плотно, что цитоплазматический фон плохо различим. В зрелых эозинофилах и базофилах PAS-положительный материал располагается следующим образом: специфические гранулы остаются неокрашенными и резко выделяются на фоне диффузного окрашивания цитоплазмы.

В моноцитах PAS-положительный материал чаще выявляется в виде мелкой пылевидной зернистости на фоне светло-розового диффузного окрашивания.

В норме от 3 до 10% клеток эритроидного ряда содержат мукополисахариды.

В тромбоцитах PAS-положительный материал выявляется в виде мелких рассеянных гранул по периферии клетки либо в виде интенсивного центрально расположенного пятна.

В лимфоцитах концентрация мукополисахаридов меньше, чем в гранулоцитах. В норме 2 – 30% лимфоцитов периферической крови содержат PAS-положительный материал, располагающийся в виде гранул вокруг ядра, в 1-2% клеток гранулы могут быть интенсивно окрашены и образуют крупные блоки.

Нормальные цитохимические показатели содержания гликогена в лейкоцитах 95–100% нейтрофилов. PAS-реакция выявляется в диффузной форме. От 2 до 30% лимфоцитов содержат PAS-положительное вещество в гранулярной форме.

Клиническое значение определения PAS-реакции
При диагностике острых миелобластных лейкозов бластные клетки могут быть либо PAS-отрицательными, либо обнаруживать слабодиффузное окрашивание цитоплазмы. Яркое диффузное окрашивание цитоплазмы наблюдается только при остром промиелоцитарном лейкозе. В монобластах реакция может быть отрицательной, слабо положительной в диффузной или диффузно-гранулярной форме (когда продукт реакции выявляется в виде рассеянных мелких или средних гранул, располагающихся по краю цитоплазмы, на диффузном фоне). В то же время при ОЛЛ бласты содержат гликоген в цитоплазме в виде средних и крупных гранул, располагающихся венчиком вокруг ядра, иногда сливающихся в блоки, на неокрашенном фоне. Количество клеток с таким характером PAS-реакции сильно варьируется при различных случаях ОЛЛ.

Неспецифические эстеразы

Термином «эстераза», или «неспецифическая эстераза» обозначены ферменты, способные гидролизовать простые эфиры N-свободных спиртов и органических кислот.

Неспецифические эстеразы – неоднородная группа ферментов, отличающихся друг от друга по субстратной специфичности и действию активаторов и ингибиторов. Все неспецифические эстеразы являются лизосомальными ферментами. В гематологии наиболее часто определяют a-нафтилацетатэстеразу, хлорацетатэстеразу, кислую a-нафтилацетатэстеразу (по методу Loffler). Эти ферменты получили название от субстратов, которые они гидролизуют, и от реакции среды, где они проявляют свое действие. a-нафтилацетатэстераза обнаруживается во всех клетках миелоидного ряда начиная с миелобласта. Активность ее выявляется в эозинофилах вне всякой связи с их специфической зернистостью, в небольшом числе лимфоцитов, эритрокариоцитах, мегакариоцитах и тромбоцитах. Самую интенсивную реакцию дают моноциты и макрофаги. Использование в качестве субстрата нафтил-AS или AS-D-ацетата дает положительный результат в большинстве клеток, но особенно высокая активность выявляется в моноцитах. Активность неспецифической эстеразы в клетках моноцитарного ряда легко ингибируется фторидом натрия, но не подавляется в гранулоцитах. Этот феномен позволяет отличить клетки системы мононуклеарных фагоцитов от клеток других ростков кроветворения, обладающих активностью неспецифической эстеразы. Активность нафтил-AS-D-хлорацетат-эстеразы выражена в клетках гранулоцитарного ряда и отсутствует в клеточных элементах моноцитарного и лимфоцитарного ряда. Кислая a-нафтилацетатэстераза рано выявляется в процессе дифференцировки Т-лимфоцитов и локализуется в виде фокального пятна в цитоплазме этих клеток.

Клиническое значение определения эстераз Определение активности неспецифической эстеразы используется для идентификации лейкозных моноцитарных предшественников. Эти клетки, как правило, проявляют высокую активность неспецифической эстеразы с субстратами бутират, ацетат и AS-D-ацетат, которая в значительной степени ингибируется фторидом натрия.

Реакция на нафтол-AS-D-хлорацетатэстеразу по своей надежности выявления гранулоцитарной направленности дифференцировки сравнима с пероксидазной реакцией. Реакция на a-нафтилацетатэстеразу является наиболее достоверной для идентификации монобластного и моноцитарного типов лейкозов.

Отсутствие точных количественных методов оценки цитохимических реакций не позволяет использовать их в отдельности для определения степени дифференциации бластов, в ряде случаев применяют полуколичественный метод оценки результатов в условных единицах или с вычислением среднего цитохимического коэффициента (СЦК). Принцип его заключается в оценке интенсивности окраски и числа положительных гранул при анализе 100 клеток.

Оценка результатов в условных единицах	Вычисление среднего цитохимического коэффициента по формуле Astaldi и Verga:
3С+2B+A	СЦК=3С+2B+A/100

Где:
А – количество клеток со слабоположительной реакцией;
В – количество клеток с умеренно положительной реакцией;
С – количество клеток с резко выраженной реакцией.
При этом показатель активности реакции в условных единицах может колебаться от 0 до 300, а СЦК – от 0 до 3%.

+ – слабодиффузное окрашивание или единичные гранулы в цитоплазме;
++ – диффузная окраска цитоплазмы, наличие умеренного числа гранул;
+++ – интенсивное окрашивание цитоплазмы, многочисленные гранулы, заполняющие всю клетку.

После оценки интенсивности окраски цитохимической реакции проводят расчет результатов в условных единицах или СЦК.

Использования стандартной панели цитохимических методов – МПО, липидов, PAS-реакции, реакции на неспецифическую эстеразу – в большинстве случаев бывает достаточно для выявления линейной принадлежности опухолевых клеток и определения варианта острого лейкоза.

На схеме представлен алгоритм цитохимической диагностики острых лейкозов на основании последовательного применения основных цитохимических реакций.

Цитохимические исследования имеют большую практическую ценность для диагностики острых лейкозов при условии, что данные, полученные при проведении различных реакций, учитываются комплексно и не происходит неоправданная завышенная оценка специфичности отдельной реакции. В значительной степени правильность интерпретации результатов реакции зависит от точности ее проведения, качества используемых реактивов, соблюдения условий забора исследуемых клеточных образцов, их приготовления, фиксации и инкубации. Во многом эти проблемы на практике могут быть решены благодаря использованию цитохимических наборов серии «ДИАХИМ-ЦитоСтейн» производства НПФ «Абрис+».

Примечание. Иллюстрации взяты из монографии Е.М. Почтаря и др. «Цитохимическая диагностика в лабораторной гематологии».

к главной странице | к содержанию | к предыдущей странице | к следующей странице |